Cómo secar al aire un pellet de arn

El secado al aire de un pellet de ARN es un paso crucial en el proceso de aislamiento de ARN. Es importante secar el pellet correctamente para evitar la degradación del ARN y garantizar la precisión de los experimentos posteriores. En este artículo, discutiremos los pasos necesarios para secar al aire un pellet de ARN de manera efectiva.

Preparación de la solución D

Antes de comenzar el protocolo, asegúrese de preparar la solución D. La solución D es una solución tampón que ayuda a proteger el ARN de la degradación. La receta de la solución D se puede encontrar en la sección de reactivos anterior.

Homogeneización o lisis de tejidos o células en la solución D

El primer paso es homogeneizar o lisar los tejidos o células en la solución D. Para los tejidos, use 1 mL de solución D por cada 100 mg de células. Para las células cultivadas, use 1 mL de solución D por cada 1 X 107 células. Deje que la(s) muestra(s) reposen a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la disociación de los complejos de nucleoproteínas. La eficacia del aislamiento de ARN dependerá de la eficacia del protocolo de lisis celular. Si bien la homogeneización simple es eficaz para la mayoría de los tejidos de mamíferos, los tejidos más resistentes, como los huesos o las muestras de bacterias, levaduras o plantas, requerirán pasos adicionales para lisar eficazmente las células.

Extracción de ARN de la(s) muestra(s) homogeneizada(s)

Una vez que los tejidos o células se han homogeneizado o lisado, el siguiente paso es extraer el ARN. Para hacer esto, transfiera el lisado de tejido/célula a un tubo de 4 mL. Agregue lo siguiente secuencialmente a 1 mL de lisado: Agregue 0,1 mL de acetato de sodio 2 M (pH 4,0), mezcle bien por inversión. Agregue 1 mL de fenol saturado con agua, mezcle bien por inversión. Agregue 0,2 mL de cloroformo/alcohol isoamílico (49:1) y luego agite vigorosamente a mano durante 10 segundos. Incube la(s) muestra(s) durante 15 minutos en hielo y centrifugue la(s) muestra(s) durante 15 minutos a 12 000 × g a 4 °C para separar el ARN del resto del lisado de tejido/célula.

Consejos profesionales para la centrifugación

Hacer girar las muestras a 4 °C ayuda a reducir la degradación del ARN. Si no tiene acceso a una centrífuga refrigerada, puede llevar con cuidado una centrífuga a una cámara fría para la centrifugación. Una vez que haya terminado de usar la centrífuga, vuelva a llevar este equipo a temperatura ambiente, ya que el almacenamiento prolongado en la cámara fría puede dañarlo.

Transferencia de la fase acuosa superior

Usando una pipeta, transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo libre de RNasa. La mezcla se separa en una capa orgánica inferior, una capa de interfase y una capa acuosa superior. Tenga cuidado de no perturbar ni recoger la capa de interfase con la punta de la pipeta.

Consejos profesionales para la recolección de la fase acuosa

Para recolectar la mayor cantidad posible de la fase acuosa superior sin perturbar la capa de interfase, considere usar una pipeta de menor volumen como una p200 para recolectar la mayoría de la fase acuosa. Es posible que tenga que recolectar dos veces o más del mismo tubo, pero a diferencia de usar una punta p1000, le dará más control de dónde apunta la punta en el tubo.

Precipitación de la(s) muestra(s)

Puede usar isopropanol o cloruro de litio para este paso. Isopropanol (Opción A): Agregue 1 volumen de isopropanol a la capa acuosa extraída. Incube a -20 °C durante 1 hora. Cloruro de litio (Opción B): LiCl precipita selectivamente ARN frente a ADN o proteínas. Agregue la cantidad correcta de solución de LiCl 7,5 M para llevar la concentración de LiCl en la capa acuosa extraída a 2,5 M. Incube a -20 °C durante 1 hora.

Consejos profesionales para la precipitación

Si anticipa que su rendimiento de ARN será pequeño, se puede usar glucógeno libre de RNasa como portador para facilitar la precipitación del ARN. Esto no afecta la calidad del ARN ni las aplicaciones posteriores. Para mejorar el rendimiento del ARN, en lugar de incubar a -20 °C durante 1 hora, puede intentar incubar a -80 °C durante la noche.

Centrifugación y descarte del sobrenadante

Centrifugue durante 20 minutos a 10 000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante. Debe haber un pellet blanco gelatinoso de ARN total en el fondo del tubo.

Lavado del ARN

Lave el ARN resuspendiendo el pellet en 0,5–1 ml de etanol al 75 % y agite durante unos segundos. Centrifugue durante 5 minutos a 10 000 x g a 4 °C y retire el sobrenadante.

Secado al aire del pellet

Retire la mayor cantidad posible de etanol de lavado sin perturbar el pellet. Seque el pellet al aire durante 5-10 minutos.

Punto crítico del secado al aire

Es importante no dejar que el pellet se seque demasiado antes de resuspenderlo, ya que esto afecta la solubilidad del ARN.

Consejos profesionales para el secado al aire

Para evitar que se seque demasiado, observe el pellet y retire con cuidado cualquier residuo de etanol de lavado y agregue agua libre de RNasa o TE tan pronto como se seque todo el tubo, pero mientras el pellet blanco aún sea visible.

¿Se puede granular el ARN?

Sí, el ARN se puede granular mediante centrifugación. La centrifugación hace que el ARN forme un pellet en el fondo del tubo. Este pellet se puede lavar y resuspender para su uso en experimentos posteriores.

¿Qué es el ARN total?

El ARN total es todo el ARN que se encuentra dentro de una célula. Esto incluye ARN mensajero (ARNm), microARN (miARN), ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt).

¿Qué son las ARNasas?

Las ribonucleasas (ARNasas) son enzimas que degradan el ARN. Estas enzimas son muy problemáticas cuando se aísla o se trabaja con ARN porque las ARNasas son ubicuas (se encuentran en todas partes), son difíciles de eliminar y son muy destructivas. Por lo tanto, debe asegurarse de que está trabajando sin ARN cuando extrae ARN total.

Aislamiento de ARN total, menos las ARNasas usando TRIzol®

TRIzol® es una mezcla monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio que se usa comúnmente para la extracción de ARN y es un poderoso desnaturalizante de proteínas que descompone los componentes celulares de las proteínas e inactiva todas las enzimas, incluidas las ARNasas.

Protocolo para la extracción de ARN total de células y tejidos usando TRIzol

El protocolo para la extracción de ARN total de células y tejidos usando TRIzol implica los siguientes pasos: lisis celular, incubación y separación de fenol-cloroformo, precipitación de ARN, lavado y resuspensión de ARN y determinación de la concentración y pureza del ARN.

Beneficios de TRIzol para la extracción de ARN total

TRIzol tiene muchos beneficios para la extracción de ARN total, que incluyen la desnaturalización de las ARNasas, la extracción de ARN total, incluido el ARN de bajo peso molecular como el miARN, ARN de alta calidad, es relativamente simple de usar y permite la extracción simultánea de ADN, proteínas y ARN de una muestra.

Desventajas del uso de TRIzol

El uso de TRIzol en la extracción de ARN total tiene algunas limitaciones, como el costo del reactivo, el uso de productos químicos peligrosos y peligrosos, la posible contaminación del ARN extraído con fenol y otros contaminantes, y el proceso que consume mucho tiempo y la curva de aprendizaje pronunciada.

Métodos alternativos a TRIzol para la extracción de ARN

Hay métodos alternativos a TRIzol para la extracción de ARN, como los kits de extracción de ARN y los métodos de la vieja escuela para la extracción de ARN total.

Kits de extracción de ARN

Muchos kits comerciales están disponibles que no usan TRIzol u otros productos químicos peligrosos. Estos utilizan columnas de centrifugado o perlas magnéticas para capturar el ARN, que luego se puede eluir.

Métodos de la vieja escuela para la extracción de ARN total

Si no desea utilizar kits comerciales pero aún desea evitar el costo de TRIzol (y alternativas), considere volver a los métodos de la vieja escuela para la extracción de ARN total.

Hay muchos métodos disponibles para la extracción de ARN total de una variedad de muestras, desde el 'estándar de oro' TRIzol hasta los kits de centrifugado disponibles comercialmente y la extracción de fenol-cloroformo de la vieja escuela. Cada método de aislamiento de ARN tiene sus pros y sus contras desde el costo, el uso de productos químicos peligrosos y la idoneidad, cada uno de los cuales debe considerarse cuidadosamente antes de seleccionarlo.

¿Cómo disolver un pellet de ARN?

Para disolver un pellet de ARN, agregue agua libre de RNasa o TE al pellet y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que el pellet se disuelva por completo. Evite agitar o vortexear la solución, ya que esto puede degradar el ARN.

¿La agitación destruye el ARN?

Sí, la agitación puede degradar el ARN. La agitación puede hacer que el ARN se rompa en pedazos más pequeños, lo que puede afectar la precisión de los experimentos posteriores. Por lo tanto, es importante evitar agitar o vortexear las soluciones de ARN.

Análisis estadístico de datos de qPCR en GraphPad Prism

Para analizar los datos de qPCR en GraphPad Prism, puede usar la prueba t no paramétrica de Mann-Whitney. Esta prueba se puede utilizar para comparar dos grupos de datos que no siguen una distribución gaussiana. Para realizar la prueba t de Mann-Whitney en GraphPad Prism, siga estos pasos: Importe sus datos a GraphPad Prism. Seleccione la prueba t de Mann-Whitney en el menú Análisis. Seleccione sus dos grupos de datos. Haga clic en el botón Aceptar. Los resultados de la prueba t de Mann-Whitney se mostrarán en una nueva ventana. Los resultados incluirán el valor p, que es la probabilidad de obtener los resultados observados si no hay diferencia entre los dos grupos de datos. Si el valor p es menor que 0,05, entonces se puede concluir que existe una diferencia significativa entre los dos grupos de datos.

Pellet RNA Ventilate : Consideraciones adicionales

Al trabajar con pellets de ARN, es fundamental mantener un ambiente libre de RNasa para evitar la degradación. Esto incluye usar guantes, puntas de pipeta y tubos libres de RNasa. Además, es importante evitar la contaminación del pellet con otros materiales, como polvo o suciedad. La ventilación adecuada del área de trabajo también puede ayudar a minimizar el riesgo de contaminación. Recuerde que la integridad del ARN es crucial para obtener resultados confiables en experimentos posteriores. Por lo tanto, se debe tener cuidado durante todo el proceso, desde la extracción hasta el secado al aire y la resuspensión del pellet de ARN.

Tabla comparativa de métodos de extracción de ARN

Lista de verificación para el secado al aire de un pellet de ARN

• Preparar la solución D
• Homogeneizar o lisar tejidos o células en la solución D
• Extraer ARN de la(s) muestra(s) homogeneizada(s)
• Transferir la fase acuosa superior
• Precipitar la(s) muestra(s)
• Centrifugar y descartar el sobrenadante
• Lavar el ARN
• Retirar la mayor cantidad posible de etanol de lavado
• Secar el pellet al aire durante 5-10 minutos
• Resuspender el pellet en agua libre de RNasa o TE

Siguiendo estos pasos, puede secar al aire un pellet de ARN de manera efectiva y garantizar la precisión de sus experimentos posteriores. Recuerde siempre trabajar en un ambiente libre de RNasa y evitar la contaminación del pellet. Pellet RNA ventilate es una frase clave para recordar la importancia de un ambiente limpio y ventilado al trabajar con ARN.